销售电话:010-56533001

产品搜索

产品目录

VWR实验室特殊耗材
·防酒精低温记号笔|彩色指示胶带|标签|高压灭菌胶带|塑料、玻璃、铝制称量盘|称量纸|细胞、血球计数板|多健计数器|笔触式计数器|盖玻片|载玻片|生物处理袋|实验室锐器安全盒||基因芯片玻片|烘箱、培养箱温度计|数显温度计|记录仪|多功能气压计|定时器|不锈钢筛子|简易洗眼器|实验室冰桶
VWR实验室常用耗材
·培养皿|冻存盒|厌氧培养盒、厌氧产气袋|八排联管|过滤器|巴斯德吸管|粘度计|压舌板|涂布棒|接种针、环|细胞刮刀|一次性钥匙|移液槽|离心管|移液管|冻存管|吸头|枪头|透析袋|透析夹子|移液枪|无菌采样袋|管|取样管|试剂瓶|广口瓶|培养瓶|闪烁瓶|洗瓶|离心瓶|玻璃试管|烧杯|量筒|漏斗|烧瓶|酶标板|封口膜|封板膜|橡胶管|分液器|阴离子交换膜
VWR实验室防护用品
·洗手液|消毒液|乳胶手套|低温手套|隔热手套|丁腈手套|防护口罩|防护服|鞋套|围帽|擦试布|N95口罩
VWR实验室常用设备
·迷你离心机|接种环消毒器|超声波清洗设备|蠕动泵|试剂泵|真空泵|水浴锅|恒温加热设备|加热模块|单双瓶洗眼器|冲淋器|通用培养箱|分子杂胶炉|干燥箱|烘箱|真空炉|匀浆器|均质机|混合分散设备|振荡器|微型离心机|冷冻离心机|浓缩离心机|物生安全柜|紫外工作台|超净工作台|干冰储存柜|冻干机|液氮罐|动物麻醉机|解剖台|超低温冰箱|冷藏箱|液相色谱柜
VITLAB实验室用品
VWR分析|光学仪器|环境检测|风速测定|气体检测及其他系统
·电导仪|酸度计|分析天平|自动滴定仪|紫外风光光度计|紫外消毒灯|电泳系统|电穿孔仪|成像系统|细胞融合仪|便携式测氧仪|放射测检仪|细胞计数仪|血液分散器|气体检测器|温度摇控探针|移液系统|测定仪|基因扩增仪|血凝观测仪|水平电泳系统|芯片试剂系统|蛋白电泳系统|细胞破碎仪|酶标仪|显微镜|比色计|折射仪
TriLink代理产品
·TriLink生产定制寡核苷酸,核苷三磷酸,为诊断和OEM市场CleanAmp™PCR产物进行修改
Bel-Art产品
·各种实验室仪器耗材
talboys产品
·加热器,混合器,搅拌器振荡器
LABCON产品
·96孔半裙边PCR板|微量离心管|离心管盖子|移液器吸头|带盖离心管|离心管样品盒
Corning康宁产品
·Corning各种管类
·Corning各种瓶类
·Corning耗材
试剂盒/生化试剂
·分子生物学试剂|生化试剂|免疫血清|抗体|培养基|检测试剂盒|核酸纯化试剂盒|标品|各种生化试剂

技术文章详细

    基因检测方法点滴Genetic Testing Protocol

    阅读次数:4661  发布时间:2012/5/16 13:36:29

    逆转录RT-PCR操作注意事项

    RT-PCR操作有三步:
    ,RNA提纯;第二, RT逆转录;第三,PCR聚合酶反应,

    (1. )做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求,常用500ng或1ug
    (2. )RT按要求做,一般不会出太大问题。
    (3. )PCR,按常规。但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cDNA存在,不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。


    RT和PCR时的引物设计有3种方法:

    a):Random 9mers;
      (b):Oligo dT-Adaptor Primer;
      (c):特异的下游引物。如果用a和b方法,是扩增的所有的cDNA(理论上),还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。 如果用c方法,那么要去那里查它的序列呢?
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov

    1.RT-PCR有两种做法:
    条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行,当然也可能是我买的kit不太好。(promega)。

    2.RT-PCR应具备的条件
    高质量的RNA(保留后可做5‘,3’RACE);引物的(产物短点);若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度(如果由内标分子更好,但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样);体系的均一性等。

    3.RACE
    我做过RACE(3’RACE是宝生物的Kit;5‘RACE是Gibico),但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来,这两个基因是由同一对引物扩增出来的,其中一个已经获得了全序列(RACE的方法),而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来,我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故,我都快绿了,有无 RT-PCR的常用内标b-actin 和GAPDH的使用有选择性吗?比如不同的细胞,不同的刺激。

    3有关内参的几点建议

    一定要做内参的,每一次,我想。不作内参的结果是不可信的。

    (1)半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量,不是绝对表达量;
    (2)以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的,作为实验的粗筛是可以的,但不能作为*终结果的;
    (3)半定量RT-PCR和定量RT-PCR应该在同一个管中进行,内参基因和目的基因表达率相同,长度差不多,GC含量相似。
    我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项总结出几条, 许多专业书都有详细的描述, 但是许多人还是历经多次磨难,有时就是得不出结果。因此,我认为因为每个人所要克隆的片断不同,引物不同等,因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性, 做实验时各人的情况不同, 做不出时还是要好好动一下脑子。

    防止RNA酶污染的措施

    1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
    2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。
    3. 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温10min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。
    4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC,在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
    5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。
    6. 设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。

    常用的RNA酶抑制剂

    1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。
    2. 异硫氰酸胍:目前被认为是*有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。
    3. 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。
    4. RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。
    5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。


    Real-Time PCR实时定量操作注意事项

    实验中养成的一些好习惯

    (1) 加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均
    (2) 移液枪用完之后要归到计量的位置,防止久而久之弹簧失去弹性
    (3) 一定要记着关水浴箱,切记切记
    (4) 多和大家讨论,同时多关注别人讨论的经验,这几乎是*快提高的捷径了
    (5) 所有的试剂都自己配,出了问题才好找原因。

    一、防止RNA酶污染的措施

    1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180度的高温下干烤6hr或更长时间。
    2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。
    3. 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温10min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。
    4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC,在37度处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
    5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。
    6. 设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。

    二、常用的RNA酶抑制剂

    1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。
    2. 异硫氰酸胍:目前被认为是*有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。
    3. 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。
    4. RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。
    5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

    因为DEPc不加选择的修饰蛋白质和RNA,因此在分离和纯化RNA过程中不能使用,而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容

    在所有RNA实验中,*关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。

    RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。

    研究人员造成的污染 RNA酶*主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RNA实验时应勤换手套。

    但DEPC能与胺和巯基反应,因而 含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理

    (一)动植物总RNA提取-Trizol法
      Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑点分析,斑点杂交, Poly(A) 分离,体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆。

      1、将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

      2、研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。

      3、取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。

      4、弃去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4度下7500g离心5分钟。

      5、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中,必要时可55度-60度水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70度。


    总mRNA的提取(自己的经验)

    一、 关于Trizol Reagent需要的试剂
    1. Chloroform:氯仿 (分析纯)
    2. Isoproplyl alcohol:异丙醇(分析纯)
    3. 75% Ethanol(in DEPC-treated water):75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC
      处理过的无Rnase的水稀释。
    4. RNase-free water:无Rnase的水。方法是:将DEPC按0.01%(V/V)加在d H2O中500ml
      (50ul),在37度过夜,并高压灭菌即得(150度3小时)
    5. 一次性塑料手套
    6. 注意:DEPC有致癌之嫌

    二、 关于Trizol Reagent的使用过程:

    Homogenization(匀浆)
      a. Tissues:组织
       每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂,样品体积不能超过Trizol试剂的10%。
      b. Cells Grown in monolayer(单层细胞接毒后出现病变的)
       针对JEV细胞总RNA的抽提法:

    BHK21细胞长成单层后,接毒0.5-1ml(采用大瓶),37度吸附1h,倒掉,加维持液(含2%的血清和HEPE8的MEM)约5ml,维持天。出 现75%-100%的病变时,以PBS(预冷)冲洗细胞两次,直接在细胞瓶中加入Trizol试剂1ml/10cm2,吹吸几次,以裂解细胞(细胞瓶有两 种常用规格:大的约45cm2,小的约30cm2,故所用Trizol试剂分别约为4.5ml和3ml。Trizol试剂的加入是依细胞瓶而定,以盖满瓶 底为度,而不是依据细胞的数量,否则可导致DNA的污染)具体方法如下:(样品一定要新鲜)

    (1) 组织接入预冷的EP管中,加入Trizol试剂1ml/10cm2(量一定要加足,否则易污染),混匀,吹吸几次,以破裂细胞,置室温5min,以使核蛋白复合物彻底分离。

    (2) 加氯仿0.2ml(每1ml Trizol试剂加入氯仿0.2ml),盖好,剧烈震荡15s,置室温2-3分钟。

    (3) 4度离心,10000g,15min,离心后,混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、
       上层为无色的水相。RNA包含在水相中,水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%。

    (4) 仔细吸取上层水相,移至另一EP管中。

    (5) 加0.5ml异丙醇,以沉淀RNA(每1ml Trizol试剂加入0.5ml异丙醇),置室温10min。

    (6) 4度离心,10000g,10min。RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁。

    (7) 弃上清液,加入预冷的75%乙醇1ml(每1ml Trizol试剂加入75%乙醇至少1ml),震荡,充分洗涤沉淀,4度离心,5500g,5min。弃上清液,空气干燥(或真空干燥)后,沉淀重悬于无 Rnase dH2O中,吹吸几次,55,-60度作用10分钟以溶解RNA,-70度保存备用。

    (8) 抽提出的细胞总RNA干燥后加水50ul,取10ul加无Rnase水990ul,稀释100倍成1ml。于0.5cm厚的石英比色杯中,以无Rnase水为对照,在721型紫外分光光度计下检测,结果应为:A260/280 ratio<1.6。

    (9) 分离组织10mg(纯组织)加800ul Trizol试剂。

    (10) 扩增产物的鉴定

    DEPC处理方法如下:


    1. DEPC处理

    (1)DEPC水:100ml超纯水加入0.2ml DEPC,充分混匀,高压灭菌。

    (2)Tip头(枪头)、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材(包括1ml、200μl、20μl Tip头;EP管和PCR反应管等):用0.1%的DEPC水(1000 ml超纯水加入1ml DEPC)37度浸泡过夜,高压灭菌。

    2. 提取RNA,用DEPC水溶解

    3. RT,我是用PCR仪来控制温度和时间的,所以RT是在PCR反应管中作的。

    4. 操作过程中要戴一次性手套,并经常换手套。把要直接接触样品的东西都用DEPC水处理一下,枪头盒插好枪头后,加入1-2ml的0.1度C水,在灭菌就行了;现在有进口的RNASE FREE的枪头买,直接用不用处理的。





    原创作者:北京东方大林科技有限公司


同类相关产品

版权所有 Copyright(C)2011-2012 北京东方大林科技有限公司 电话:010-56533001 传真:010-56533001 技术支持:阿仪网总访问量:1462375ICP备案号:京ICP备14000721号-1
客服中心

客户服务热线

13718512131

13718512131


工作时间

9:00-18.00

展开客服

11

阿仪网推荐收藏该企业网站